台湾佬中文网 一株分离自流浪猫的猪链球菌9型的分子生物学纵情

猪链球菌是一种能引起猪的脑膜炎、要害炎和败血症的致病菌，并可感染东说念主[1， 2]。把柄猪链球菌荚膜抗原的千般性，可将猪链球菌分为33个血清型(1-31、33和1/2)[3， 4]。1998年，江苏爆发了一场猪链球菌病，病原主要为猪链球菌2型，形成了25例感染[5]。2005年7月，四川又出现了一次大爆发，多达215东说念主感染，且还伴有其他省市的荒芜感染[6， 7， 8]。到2012年底，文件报说念的猪链球菌感染的案例多达1584起，其中大部分是感染猪和东说念主的案例[9]。猪链球菌还可形成多种哺乳动物的荒芜感染，如家牛、野牛、马、绵羊、山羊、家禽和野猪[10， 11， 12， 13， 14]。据咱们所知，尚未有猪链球菌感染流浪猫的报说念。本商议中台湾佬中文网，咱们从广西的流浪猫身上分离到一株猪链球菌，在国内尚属初度。

1 材料和门径 1.1 主要仪器和试剂

PCR仪购自日本TaKaRa公司；分光光度计购自好意思国Bio-Rad公司；THB (Todd-HewittBroth)培养基购自英国Oxoid公司；MHA(Mueller-Hinton Agar)培养基购自英国Oxoid公司；基因组索求试剂盒购自好意思国Omega公司；胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；PCR mix购自日本TaKaRa公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；猪链球菌33种圭臬血清由中国动物卫生与流行病学中心惠赠。

1.2 细菌的分离与纵情

从广西无认知症状的流浪猫身上麇集246份肝脏和肺脏的样品，将样品在75%的乙醇中浸泡15 min消毒，随后用无菌剪刀在样品上剪开一小口，用无菌接种环在剪开的小口内蘸取样品，划线接种于THB平板，然后将平板特别于37 °C温箱培养过夜。次日挑取疑似菌落放入液体THB中培养，并进行革兰氏染色纵情。

1.3 猪链球菌的种特异性纵情

用基因组索求试剂盒索求m70的基因组DNA，以此为模板，以gdh基因特异性引物gdh-F和gdh-R[15](表1)扩增猪链球菌特异性片断。PCR门径为：94 °C 5 min；94 °C 1 min，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30个轮回；72 °C 10 min。以m70基因组DNA为模板，以16S rRNA通用引物[16] 16S rRNA -F和16S rRNA -R(表1)扩增16S rRNA特异性条带。PCR门径为：94 °C 5 min；94 °C 1 min，55 °C 30 s，72 °C 1.5 min，30个轮回；72 °C 10 min。PCR居品用1%琼脂糖凝胶进行电泳，再用胶回收试剂盒回收特异性条带，并送公司测序，测序后果在GenBank上用BLAST进行比对。并用MAGE 5.1的Neighbor-Joining Algorithm[17]门径对m70和NCBI上已公布的18株猪链球菌的16S rRNA的序列构建系统发育树。

1.4 血清型纵情

用经典的血清凝集践诺对m70的血清型进行纵情。将m70培养至对数期，随后5000 r/min离心15 min，弃上清台湾佬中文网，菌体用灭菌生理盐水洗涤2遍，随后以相通体积重悬于灭菌生理盐水中。将菌体重悬液永别与猪链球菌的33种圭臬血清进行玻片凝集践诺，不雅察是否出现凝集时局，生理盐水手脚阴性对照。为进一步纵情m70的血清型，又用猪链球菌9型特异性纵情引物cps9-F和cps9-R[18]对m70 DNA进行了扩增，同期用猪链球菌9型菌株NJ-2的DNA和ddH2O手脚阳性和阴性对照模板。PCR门径为：94 °C 5 min；94 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min，30个轮回；临了72 °C 5 min。PCR居品用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，再用胶回收试剂盒回收特异性条带，并送公司测序，测序后果在GenBank上用BLAST进行比对。

h动漫 1.5 MLST 分型

对m70进行多位点序列分型(Multiple locus sequence typing ，MLST)。把柄MLST数据库()公布的7个看家基因(dpr、mutS、cpn60、thrA、recA、aroA和gki)的引物序列对m70的基因组DNA进行PCR扩增[19]。PCR居品用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，再用胶回收试剂盒回收相应条带，回收居品送公司测序，所得序列到MLST数据库比对，进行序列型(sequence type，ST)分析。

1.6 药敏考试

把柄好意思国临床和践诺室圭臬协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)[20]的圭臬进行药敏考试。用含有5%的小牛血清的MH培养基将m70培养至OD600 = 0.08-0.13 (相当于0.5麦氏浓度圭臬)，用灭菌棉签将菌液均匀的涂布在MHA平板上，然后将氯霉素、氟苯尼考、红霉素、四环素、环丙沙星等13种药物(表2)的药敏纸片平均贴在涂有细菌的平板上，每块平板上最多贴5个药敏纸片，随后将平板特别于37 °C温箱培养过夜，次日把柄抑菌圈直径判断细菌对各药物的明锐性。

1.7 小鼠致病性考试

参照陈涛[21]等的门径，将m70培养至对数期，5000 r/min离心10 min，弃上清，菌体用无菌PBS洗涤3次，然后将菌体用无菌PBS稀释到允洽浓度。将25只BALB/c雌性小鼠当场分为5组，每组5只，每组腹腔打针一个梯度，永别为108、107、106和105 CFU (表3)，空缺组小鼠每只打针0.2 mL PBS。同期继承相通的门径用践诺室保存的猪链球菌强毒株HA9801对BALB/c小鼠攻毒。攻毒后不雅察7 d，纪录小鼠的物化情况，考试重迭3次。

2 后果和分析 2.1 细菌的分离与纵情

显微镜下不雅察，m70株呈短链状的革兰氏阳性球菌(图1-A)。在血平板上形成草绿色α溶血环(图1-B)。用特异性引物扩增猪链球菌特异性基因gdh，在688 bp位置出现特异性条带，经测序比对，该序列与NCBI上猪链球菌2208株的gdh基因序列的同源性高达98% (675/688)。16S rRNA扩增也出现1500 bp的特异性条带，经测序比对，该序列与NCBI上猪链球菌的16S rRNA基因序列的同源性达到99% (1482/1490)，由此详情m70为猪链球菌。m70和NCBI上其他猪链球菌的16S rRNA基因的系统发育树分析后果裸露，m70株位于一个单独的分支上(图2)，这可能与m70的宿主特异性关连。

2.2 血清型纵情

血清凝集考试后果裸露，m70菌液与猪链球菌9型圭臬血清发生凝集响应，标明m70血清型为9型。为进一步详情其血清型，咱们以9型特异性引物cps9对m70的DNA进行了PCR扩增，后果在484 bp位置出现特异性条带(图3)，阳性对照NJ-2也扩增出484 bp的条带，而阴性对照则未扩增出条带，进一步说明m70血清型为9型。临床分离的致病性猪链球菌除2型外，9型亦然一个流行的血清型[22]。 欧洲阐述国度如澳大利亚、荷兰、比利时、德国等地往常的从病猪身上分离到猪链球菌9型[23]。夙昔几年的流行病学探望后果裸露，在中国，猪链球菌9型的流行也呈逐年高潮的趋势[24]。猪链球菌在感染进程中并莫得严格的宿主特异性，它可形成多种哺乳动物的荒芜感染，而流行血清型的菌株有更多的契机战斗不同的宿主，因此本考试可在流浪猫身上分离到一株9型菌株，辅导临床崇高行血清型的菌株感染猪之外其他宿主的几率更高。

2.3 MLST 分型

MLST分型后果裸露，m70株属于一个新的ST型。据之前的报说念，我国主要流行的ST型为ST7 和ST1[25， 26， 27， 28]。成心念念的是，m70属于一个新的ST型，这与m70的16S rRNA系统发育树属于一个单独的分支的后果相对应。天然m70属于一个流行的血清型9型，但它在16S rRNA系统发育树上属于一个单独的分支，ST分型上也属于一个新的型，这可能与它不寻常的宿主特异性关连。

2.4 药敏考试

药敏后果裸露，m70株对四环素耐药，对红霉素中介耐药，对氨苄西林、环丙沙星、氯霉素和恩诺沙星明锐(表2)。全国规模内猪链球菌临床分离株多数对大环内酯类和四环素类耐药，对大环内脂类的耐药率高达70%，而对四环素类耐药率高达90%[29]。由于四环素类和大环内脂类抗生素被庸碌用于临床猪链球菌病的防控，我国猪链球菌临床株主要对四环素和红霉素耐药，对青霉素比拟明锐[30]，这与本考试后果一致。天然m70分离自流浪猫，但其抵拒生素的耐药性仍然十分严重，可见我国抗生素耐药情况残害乐不雅。

2.5 m70株对小鼠的致病性

m70攻毒小鼠7 d后，感染剂量为108 CFU组的小鼠物化情况严重，物化率达到60%-80% (3/5-4/5)。3次攻毒考试后果裸露，小鼠的平均LD50为5.1×107 CFU(表3)。而用本践诺室保存的猪链球菌强毒株HA9801攻毒小鼠7 d后，物化情况与m70相似，感染剂量为108 CFU组的小鼠物化情况严重，物化率达到80%-100% (4/5-5/5)，平均LD50为3.9×107 CFU(表3)。由此可见，m70与强毒株HA9801对小鼠的致病力莫得显赫互异(P<0.05，图4)，标明m70株毒力较强。HA9801株是98年江苏爆发猪链球菌疫情时在患有败血症的病猪身上分离到的，毒力较强[31]。m70株与强毒株HA9801 毒力相当，对小鼠模子的致病力较强，在流浪猫身上却无认知症状，这标明猪链球菌天然不错荒芜感染其他哺乳动物，但对不同哺乳动物的致病力是有互异的。致病性猪链球菌可能主要导致猪和东说念主发病，但可能对其他哺乳动物致病力较弱，这就辅导猪链球菌可能存在从无认知症状的其他哺乳动物传染猪或东说念主，导致猪或东说念主发病的风险。

3 论断

大部分猪链球菌感染东说念主案例齐与处事关连台湾佬中文网，如宰杀场、养猪场和肉品加工场等与猪战斗的东说念主员[4]。但猪链球菌也会形成多种哺乳动物的偶发感染。本文从流浪猫脏器上分离到猪链球菌9型m70株，在国内尚属初度报说念。m70属于新的ST型，16S rRNA系统发育树中处于一个单独的分支，这些特征与我国猪链球菌临床分离株有显赫的隔离，忖度可能与其宿主特异性关连。m70属于我国的流行血清型，且对小鼠致病性较强，辅导一些流行血清型的猪链球菌强毒株具有从流浪猫传染东说念主的潜在风险。